Listado de la etiqueta: bioensayo ratón

MBA son las siglas en inglés para Mouse Bioassay (bioensayo de ratón en la lengua de Cervantes).

Se trata del método tradicional para la detección de biotoxinas marinas en marisco, con el fin de evitar su comercialización si supera los niveles máximos permitidos. Emplea ratones albinos (mus musculus).

La legislación europea establece límites y el control de toxinas paralizantes (PSP: saxitoxina/derivados), amnésicas (ASP: ácido domoico), lipofílicas (diarreicas: DSP (ácido okadaico/derivados, pectenotoxinas), azaspirácidos; y yesotoxinas).

En el caso del DSP se pinchaban (vía intraperitoneal) 3 ratones por muestra y cuando morían 2 en <24 horas las toxinas superaban los niveles permitidos (160 microgramos por kilo de vianda). Desde 2015 los métodos para toxinas lipofílicas validados en la UE son la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) y el ensayo de inhibición de la fosfatasa. Bye bye ratoncitos…

El MBA es sin duda cuestionable, tanto técnica como eticamente. Por ello se han desarrollado y puesto a punto una serie de métodos químicos (basados en cromatografía y espectrometría de masas, ensayos inmunológicos, etc), con el fin de abandonar la penosa tarea de sacrificar animales. Esta progresión en los métodos ha restringido el uso del MBA, sólo permitido en la UE para toxinas paralizantes (PSP).

Pero mi pregunta es: ¿podemos prescindir totalmente de los ratones?

Las poquísimas veces que comento estos temas en círculos no científicos (colegios, bares, etc), muchas personas (estudiantes, profesores, amigos, el dueño del bar…), se sorprenden de que aún sea necesario utilizar animales.

Quizás por poco tiempo. En la Unión Europea los niveles máximos para las biotoxinas están pendientes de una revisión a la baja que supondría niveles de detección inalcanzables para el MBA.

Los nuevos métodos de referencia para las toxinas amnésicas (ASP) y lipofílicas son tan sensibles como para detectar esos niveles. Pero ello también supondrá previsiblemente períodos de cierre más prolongados para la venta del marisco. No soy ningún experto en el tema pero les recomiendo revisiones como la de Blanco y col. (2013) para una zona de producción tan importante como Galicia.

La situación es compleja. Cada país posee una problemática de biotoxinas distinta, los riesgos para la salud pública, el número de muestras y costes analíticos tampoco son comparables. Las biotoxinas son un reto analítico ya que poseen diferentes análogos y derivados con toxicidades bien diferentes: sólo de las toxinas paralizantes (saxitoxina y derivados) se conocen más de 50 compuestos.

El perfil de toxinas y sus niveles en moluscos varían enormemente en cada región, y tampoco hay que olvidar que los métodos químicos necesitan patrones comerciales certificados para cuantificarlas (patrones que a veces no existen).

No es que defienda el MBA, válgame Dios!, pero este método mantiene una ventaja respecto a los nuevos métodos químicos de referencia. Y no hablo de los costes de personal o equipamiento, sino de algo muy importante para proteger la salud humana: la detección de nuevas toxinas.

Más o menos, las toxinas de microalgas se descubren así: 1) alguien se intoxica (persona humana o animal), incluso a veces se muere tras comer marisco/peces. 2) Los científicos aislan la toxina, revelan su estructura química y 3) identifican al organismo responsable. Pueden pasar años, incluso décadas de trabajo, pero es el único camino para proteger la salud pública de nuevas intoxicaciones.

Hoy en día tenemos métodos químicos para numerosas toxinas de microalgas. Pero qué sucedería si apareciera un nuevo compuesto que no fuera detectable por ninguno de dichos métodos?

No podemos controlar que aparezcan nuevas toxinas pero sí mantener una barrera de seguridad y que los afectados sean ratones en vez de usted o yo.

Aún así, utilizando el MBA, hay más factores, como el diseño del muestreo o la mala suerte!, que pueden provocar que una toxina se salte los controles de seguridad y llegue a los consumidores. Tal cosa sucedió hace 20 años…

1)_Alguien se intoxica (noviembre 1995). Ocho personas sufren en Holanda síntomas de diarrea, naúseas y vómitos tras consumir mejillones importados del oeste de Irlanda (Killary Harbour).

Los mejillones se habían despachado el 10 de noviembre y los últimos análisis de toxinas del 31 de octubre (incluyendo MBA) eran negativos. Dinophysis, el organismo causante de síndrome diarreico (DSP), no había sido observado desde septiembre. Inmediatamente se prohibió la extracción de marisco en el área afectada y los análisis de DSP mediante bioensayo de ratón dieron positivo hasta el mes de febrero.

No obstante, los síntomas de los ratones eran una parálisis lenta y progresiva que no encajaba del todo con el DSP de Dinophysis.

Los métodos químicos de análisis apenas revelaron trazas de toxinas diarreicas (ácido okadaico y derivados): no podían ser responsables de la toxicidad detectada con el MBA. La misteriosa intoxicación se publicó en Harmful Algal News (McMahon & Silke, 1996) y sus autores concluyeron: «While both the rat and mouse bioassays have been criticized for their lack of specificity, in the present case their usefulness is clear in detecting the presence of an unknown toxin which can produce DSP symptoms in shellfish consumers«. [Mientras que los bioensayos de ratón han sido criticados por su falta de especificidad, en el caso presente su utilidad es clara en detectar la presencia de una toxina desconocida que puede ocasionar síntomas de DSP en consumidores de marisco].

2) Caracterización de la toxina (1998-2003). Al principio le pusieron un nombre como de misil o ametralladora: KT-3 (Killary Toxin). Fueron Satake y col. (1998) quienes la aislaron y caracterizaron en Mytilus edulis irlandeses con la etiqueta final de azaspirácido (AZA>>AZA-1). Luego se han descubierto numerosos análogos (AZA-2, AZA-3, AZA-4, etc).

Otros autores encontraron que la estructura propuesta para el AZA-1 tenía un error publicando la correcta (Nicolaou y col. 2003, etc).

3) Organismo responsable (2009). Se trataba de encontrar una aguja en un pajar (o en el mar mejor dicho). En 2001 el profesor Takeshi Yasumoto sugirió que el organismo responsable podía ser un dinoflagelado heterótrofo, Protoperidinium crassipes. Nunca se pudo confirmar (incluso usando cultivos de P. crassipes), y la sospecha de que las toxinas procedían de una presa flotaba en el aire…

La estructura del AZA-1 apuntaba a un dinoflagelado pero las toxinas suelen ser propias de especies fotosintéticas. En 2007, Krock y col. analizaron toxinas en muestras del Mar del Norte fraccionadas por tamaños y detectaron azaspirácidos en la fracción de 8-20 micras y en ciliados como Favella ehrenbergii.

Aquello excluía definitivamente a P. crassipes (>50 micras) y al fin aislaron un diminuto dinoflagelado tóxico en dicha fracción.

Eureka !! tenían la aguja !! en 2009 Tillmann y col. publicaron la caracterización de Azadinium spinosum, una nueva especie (y género) productora de AZA-1 y AZA-2.

Hoy en día, si consultan Algaebase, encontrarán 11 especies de Azadinium, su distribución es cosmopolita y la mayoría (aunque no todas), son productoras de azaspirácidos.

Probablemente se confundían con eventos DSP mientras que el liliputiense Azadinium pasaba inadvertido entre «dinos» similares como Heterocapsa. Ahora son uno de los focos de atención para el Marine Institute, responsable del seguimiento de biotoxinas marinas en Irlanda, el productor de moluscos bivalvos más afectado por AZA en todo el mundo.

Nos olvidamos de los ratones entonces? yo preferiría reducir al mínimo el MBA pero no eliminarlo del todo…en cuanto a mi gatito, él nunca olvida a los ratones aunque sean de tela !!

Referencias:

-Blanco J. y col. Evaluación del impacto de los métodos y niveles utilizados para el control de toxinas en el mejillón. Revista Galega dos Recursos Mariños (Art. Inf. Tecn.) 3:1-55 (2013). Disponible online

-Jauffrais T. Écophysiologie des dinoflagellés du genre Azadinium, production toxinique et transfert trophique vers les mollusques bivalves. Thèse de doctorat. 314 pp. (2012).

-MacMahon T, & Silke J. Winter toxicity of unknown aetiology in mussels. HAN 14:2 (1996).

-Nicolaou KC y col. Total synthesis of the proposed azaspiracid-1 structure, part 1: construction of the enantiomerically pure C1-C20, C21-C27, and C28-C40 fragments. Angew Chem Int Ed. 42:3643–48 (2003)

-Satake y col. Azaspiracid, a New Marine Toxin Having Unique Spiro Ring Assemblies, Isolated from Irish Mussels, Mytilus edulis. JACS 120:9967-68 (1998).

-Tillmann U. y col. Azadinium spinosum gen. et sp. nov. (Dinophyceae) identified as a primary producer of azaspiracid toxins. Eur. J. Phycol. 44:63-79 (2009).

-Tillmann U. y col. The dinophycean genus Azadinium and related species – morphological and molecular characterization, biogeography, and toxins. 15th ICHA Proceedings. 149-152 (2014).

-Web ZeuLab