La tercera ley de Clarke

“Cualquier tecnología lo bastante avanzada es indistinguible de la magia.”

Arthur C. Clarke (Perfiles del Futuro, 1973)

La distancia más pequeña que podemos distinguir a simple vista está en torno a los 0.1 milímetros y para ampliar objetos y seres diminutos empleamos artilugios como lupas y microscopios. Pero la propia luz tiene límites de resolución y la observación con mayores aumentos (por ejemplo de virus, <100 nm), sólo fue posible gracias a tecnologías inimaginables en un pasado no tan lejano.

Microscopios sin luz >> microscopios electrónicos

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C.A.T. Sheldon no distingue bien el verde del rojo (como los daltónicos deuteránopes). Autor: F. Rodríguez.

Los ojos detectan las señales luminosas gracias a células fotoreceptoras (conos y bastones) en la retina. Los bastones (95% de fotoreceptores) permiten detectar cambios de intensidad mientras que los conos (5%) son responsables de la visión en color.

La mayoría de la población es tricrómata, posee tiene 3 tipos de conos que permiten distinguir el espectro de colores del arcoiris.

Los daltónicos (o ciegos al color), presentan modificaciones o ausencias de algún tipo de cono (p.ej. dicrómatas). No pueden diferenciar algunos colores o en casos severos (acrómatas) sólo ven escala de grises.

Aprovecho esto para desmentir la frase de que “los perros ven en blanco y negro“. No es verdad: los perros son dicrómatas (también los gatos).

Los bastones son 40 veces más sensibles a la luz que los conos y por ello al observar organismos en el microscopio con una luz tenue (como la autofluorescencia de los pigmentos en microalgas o sondas fluorescentes) necesitamos una habitación oscura para apreciarlos bien y evitar la saturación de la rodopsina de nuestros bastones.

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La naturaleza dual de la luz. Autor: S. Tanzilli. Fuente: Newsbuzzonlive

¿Y qué es la luz? radiación electromagnética con longitudes de onda (λ) entre 400-750 nm.

Su naturaleza dual (“onda-partícula”) es desconcertante, pero disponemos de ecuaciones matemáticas (gracias a Maxwell, Einstein y muchos otros), que describen su comportamiento y la energía, frecuencia y λ de las partículas o fotones que la integran.

Los fotones son el material de cualquier clase de radiación electromagnética, no sólo de la luz visible, que como ustedes saben es una pequeña rendija del espectro electromagnético.

El color está asociado a la energía y λ de dichos fotones y el violeta y el rojo son las manifestaciones extremas en el espectro visible.

Ernst Abbe (“padre” de la óptica moderna) demostró que el límite de resolución (d) de una imagen depende de:

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Disco de Airy: puntos en el microscopio (arriba) y el límite de resolución que impone el frente de ondas de la radiación (debajo). Fuente: Zhou y col. (2007)

  • La longitud de onda de la radiación incidente.
  • La apertura numérica (NA: función del índice de refracción del medio, 1 para el aire y 1.33 para el agua).

…Y la ecuación es: = 0.612 λ / NA.

A medida que aumentamos la imagen de un objeto bajo un microscopio óptico nos acercamos al límite de resolución que alcanzamos con la luz (∼200 nm).

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Coscinodiscus sp. (diatomea). Microscopio óptico (400X). Autor: F. Rodríguez

Si queremos ver con nitidez cosas más pequeñas necesitamos emplear partículas con menor λ que los fotones de luz. Un buen símil serían los píxeles de una imagen.

Si queremos ampliarla sin perder resolución necesitamos píxeles más pequeños: la luz visible tiene píxeles demasiado gruesos para diferenciar los detalles más sutiles de la superficie o el interior de una célula.

Así que un buen día a alguien se le ocurrió utilizar electrones, más energéticos y con λ menores (2-12 picómetros según la configuración del equipo), para obtener imágenes más allá de la resolución de la luz.

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Fuente: cs.brown.edu

Ése “alguien” fueron en realidad Max Knoll y su estudiante Ernst Ruska (Nobel de física en 1986), quienes desarrollaron a comienzos de los años 30′ el primer microscopio electrónico de transmisión.

Posteriormente se crearon otros sistemas como el de barrido, con menor resolución pero capaces de obtener imágenes en 3D.

La naturaleza de esta técnica impide observar organismos vivos, pero a quién le importa…

 

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Coscinodiscus sp. a 1000X (izquierda), con detalle de los poros en la zona central a 10.000X. Microscopio electrónico de barrido. Autores: J. Méndez y F. Rodríguez (MEB del C.A.C.T.I., Universidade de Vigo).

¿Cómo funciona un microscopio electrónico?

Sustituyen la luz y las lentes del microscopio óptico por un haz de electrones y electro-imanes. Los electrones, como toda materia, tienen naturaleza dual “onda-partícula” pero la suya es una radiación ionizante capaz de extraer electrones a los átomos.

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MEB. Fuente: ACMAL

Las imágenes representan distribuciones de intensidad electrónica y al no intervenir la luz aparecen sólo en escala de grises.

La técnica de barrido (MEB o SEM en inglés) utiliza un haz de electrones focalizado en vacío para escanear la superficie del objeto, produciendo diversas señales electrónicas en los átomos de la muestra que son recogidas por un detector y convertidas a una imagen visual.

En los MEB actuales, la fuente de electrones suele ser un cañón de emisión de campo, con tungsteno como fuente de electrones. Llegan a alcanzar hasta 500.000X con una resolución de 1.5 nm.

Resulta imprescindible trabajar en vacío, para evitar la dispersión del haz electrónico. En el caso de que las muestras tengan origen biológico es necesaria una preparación previa que incluye recubrirlas de metal (oro, plata, platino, u otros no preciosos como cromo, titanio, wolframio, etc).

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Señales generadas por un haz de electrones en MEB. Fuente: Zhou y col. (2007).

Una vez que el haz de electrones incide en la superficie de la muestra éstos penetran hasta una cierta distancia antes de colisionar con sus átomos.

La profundidad de penetración depende de la energía del haz: a menor energía mayor resolución en la superficie del objeto.

Si aceleramos los electrones se pierde resolución y las superficies se muestran suavizadas.

El haz de electrones incidente o primario produce diversas señales, que incluyen electrones y rayos-X (los cuales proporcionan información útil en técnicas de microanálisis químico).

Respecto a las imágenes, la señal más utilizada en un MEB es la que procede de los electrones secundarios.

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Criptofita (Teleaulax) de nuestra colección CCVIEO. Autores: J. Méndez y P. Rial (MEB del C.A.C.T.I., U. Vigo)

Éstos poseen baja energía y apenas escapan unos pocos nanómetros de la superficie de la muestra. Indican con precisión la posición del haz incidente y facilitan información topográfica con buena resolución (superior a los 10 nm).

En este blog podrán encontrar imágenes de MEB espectaculares en Maravillas de Canarias.

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Micromonas (Mamiellophyceae), imagen coloreada de MET. Autores: Worden AZ y col. Fuente: JGI

En el caso de la técnica de transmisión (MET o TEM en inglés), se analizan muestras ultrafinas y la imagen procede de patrones de distribución e intensidad de electrones que atraviesan al objeto.

¿Diferencias con el MEB? las imágenes son en 2D y su resolución superior –podemos observar la ultraestructura celular, virus y macromoléculas

Siempre es buena idea regalar libros por Navidad y les confesaré que la culpa de esta entrada la tienen estas obras apasionantes de divulgación:

El mundo como obra de arte” (Frank Wilczek: Crítica, 2015)

Todo es cuestión de química” (Deborah García Bello: Paidós, 2016)

…Y sobre todo El ojo desnudo” (Antonio Martínez Ron: Crítica, 2016)

Son libros muy distintos que explican la naturaleza del mundo, los átomos y la luz de manera fascinante y rigurosa. Con ellos termino la última entrada del año y desde aquí les deseo lo mejor para el 2017 !!

Referencias:

-Murphy DB. Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. Wiley-Liss, 357 pp. (2001).
-Williams DB & Carter CB. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science, Volumen 2. Springer, 820 pp. (2009)
-Zhou W. y col. Fundamentals of scanning electron microscopy. En: Scanning microscopy for nanotechnology. Springer, 522 pp. (2007).

 

 

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